طراحی وکتور و پرایمر

طراحی وکتور (Vector designing) یک مرحله مهم در فرآیند کلونینگ است. وکتور قطعه کوچکی از DNA است که برای حمل DNA خارجی به داخل سلول میزبان استفاده می شود. وکتور باید قابلیت تکثیر در سلول میزبان را داشته باشد و باید یک نشانگر قابل انتخاب داشته باشد تا سلول هایی که وکتوررا گرفته اند شناسایی شوند.

انواع مختلفی از وکتورها وجود دارد که هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند. برخی از انواع متداول وکتورها شامل پلاسمیدها، وکتور‌های ویروسی و کازمیدها هستند.

پلاسمیدها (Plasmids) قطعات کوچک و دایره‌ای از DNA هستند که می‌توانند به طور مستقل در باکتری‌ها تکثیر شوند. آنها اغلب به عنوان وکتور برای کلونینگ ژن ها استفاده می شوند زیرا به راحتی قابل دستکاری هستند و به راحتی می توانند وارد باکتری ها شوند.

وکتور‌های ویروسی (Viral vectors) بر پایه ویروس هایی هستند که می توانند باکتری ها یا سلول های دیگر را آلوده کنند. آنها اغلب به عنوان وکتور برای کلونینگ ژن ها استفاده می شوند زیرا می توانند به طور موثر ژن ها را به سلول ها منتقل کنند.

کازمیدها (Cosmids) وکتور های بزرگی هستند که می توانند برای کلونینگ قطعات بزرگ DNA استفاده شوند. آنها اغلب به عنوان وکتوربرای کلونینگ ژن های یوکاریوت ها، مانند انسان، استفاده می شوند.

انتخاب وکتوربستگی به نوع ژن و سلول میزبان دارد. به عنوان مثال، اگر یک ژن از یک باکتری کلون شود، یک وکتورپلاسمید انتخاب خوبی خواهد بود. اگر یک ژن از یک انسان کلون شود، یک وکتور کازمیدی انتخاب خوبی خواهد بود.

هنگامی که یک وکتور انتخاب شد، باید طراحی شود. طراحی وکتور به ژنی که در حال کلونینگ است بستگی دارد. به عنوان مثال، اگر ژن توسط مکان‌های محدود کننده (restriction sites) خاصی احاطه شده باشد، وکتور نیز باید حاوی آن مکان‌های محدود کننده در سایت کلونینگ (cloning site) خود باشد.

سایت کلونینگ (cloning site)، همچنین به عنوان سایت کلونینگ چندگانه (multiple cloning site) یا پلی لینکر (polylinker) شناخته می شود، توالی‌ای از DNA است که حاوی چندین سایت تشخیص برای آنزیم محدود کننده (restriction enzyme) است. این مکان‌ها امکان وارد کردن DNA خارجی را به صورت کنترل‌شده در وکتورفراهم می‌کنند و به محققان این امکان را می‌دهند که توالی DNA مورد نظر را دقیقاً دستکاری کنند.

وکتور همچنین باید یک نشانگر قابل انتخاب (selectable marker gene) داشته باشد. یک نشانگر قابل انتخاب ژنی است که به سلول هایی که وکتوررا گرفته اند اجازه می دهد شناسایی شوند. برخی از نشانگرهای رایج قابل انتخاب شامل ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی (antibiotic resistance genes) و ژن های گزارشگر (reporter genes) هستند.

یکی دیگر از نکاتی که در هنگام طراحی وکترو بایستی به آن توجه کرد، منشا همانندسازی می باشد. منشا همانندسازی (replication origin) توالی‌ای از DNA است که به وکتور اجازه می دهد در داخل سلول میزبان تکثیر شود. این توالی باید با نوع سلول میزبان سازگار باشد و نباید با فرآیندهای تکثیر طبیعی و رونویسی سلول تداخل داشته باشد.

بسته به اهداف آزمایشی خاص، طراحی وکتور می‌تواند شامل ویژگی‌های دیگری مانند پروموترها (Promoters)، تقویت‌کننده‌ها (Enhancers) و دیگر توالی‌های تنظیمی (Regulatory Elements) باشد.

هنگامی که وکتور طراحی شد، می توان از آن برای کلونینگ ژن استفاده کرد. ژن ابتدا با استفاده از PCR تکثیر می شود. سپس ژن تکثیر شده با آنزیم های محدود کننده هضم شده و به وکتورمتصل می شود. سپس وکتوربسته شده به سلول میزبان وارد می شود. سپس سلول هایی که وکتور را گرفته اند با استفاده از نشانگرها، انتخاب می شوند.