آنالیز داده های Real time PCR

Real-time PCR (qPCR) تکنیکی است که برای تکثیر و کمی سازی DNA استفاده می شود. این ابزار قدرتمندی است که می تواند برای تشخیص و تعیین کمیت وجود ژن های خاص یا رونوشت های ژنی (gene transcripts) در یک نمونه استفاده شود.

qPCR بر اساس اصل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است. PCR تکنیکی است که از گرما برای دناتوره کردن DNA استفاده می‌کند و به دنبال آن پرایمرها و نوکلئوتیدها اضافه می‌شوند تا امکان تکثیر DNA فراهم شود. این فرآیند چندین بار تکرار می‌شود که منجر به افزایش تصاعدی در مقدار DNA می‌شود.

qPCR با PCR تفاوت دارد زیرا از یک پروب فلورسنت برای نظارت بر تکثیر DNA استفاده می کند. این پروب برای اتصال به ناحیه خاصی از DNA که در حال تکثیر است، طراحی شده است. همانطور که DNA تکثیر می شود، پروب نیز تقویت می شود. سپس فلورسانس پروب اندازه گیری می شود و مقدار DNA بر اساس سیگنال فلورسانس محاسبه می شود.

qPCR یک ابزار ارزشمند برای تشخیص و تعیین کمیت DNA است. در زمینه های مختلفی از جمله پزشکی، پزشکی قانونی و کشاورزی استفاده می شود.

برای تجزیه و تحلیل داده های qPCR به منظور بررسی بیان ژن مطلق (Absolute Gene Expression)، باید موارد زیر را بدانید:

• مقدار چرخه آستانه (CT)
• معادله منحنی استاندارد

مقدار CT عدد سیکلی است که در آن سیگنال فلورسانس از یک آستانه از پیش تعریف شده عبور می کند. معادله منحنی استاندارد یک معادله خطی است که مقدار CT را به غلظت استاندارد مرتبط می کند. برای محاسبه غلظت نمونه ها می توان از معادله منحنی استاندارد استفاده کرد. برای محاسبه غلظت نمونه ها باید مقادیر CT نمونه ها را روی منحنی استاندارد رسم کنید و سپس از معادله منحنی استاندارد برای محاسبه غلظت نمونه ها استفاده کنید.

همچنین می توانید از نرم افزارهای آماری برای تجزیه و تحلیل داده های qPCR استفاده کنید. برای محاسبه میانگین، میانه و انحراف معیار مقادیر CT نمونه ها می توان از نرم افزار آماری استفاده کرد. همچنین می توان از نرم افزارهای آماری برای محاسبه فاصله اطمینان غلظت نمونه ها استفاده کرد. همچنین از Real-time PCR (qPCR) برای برای اندازه گیری فراوانی نسبی (Relative Gene Expression) دو یا چند ژن در یک نمونه استفاده می شود.

برای تجزیه و تحلیل داده های qPCR برای بیان ژن نسبی، باید موارد زیر را بدانید:

• مقدار چرخه آستانه (CT) برای هر ژن
• مقدار ΔΔ CT برای هر ژن

مقدار CT عدد سیکلی است که در آن سیگنال فلورسانس از یک آستانه از پیش تعریف شده عبور می کند. مقدار ΔΔCT تفاوت بین مقدار CT ژن هدف (Target Gene) و مقدار CT ژن مرجع (Reference Gene) است. مقدار ΔΔCT می تواند برای محاسبه تغییر نسبی در بیان ژن هدف نسبت به ژن مرجع استفاده شود. تغییر نسبی به صورت زیر محاسبه می شود:

تغییر فولد نسبی (RFC) = 2 - ΔΔCT

به عنوان مثال، اگر مقدار CT ژن هدف 20 و مقدار CT ژن مرجع 25 باشد، مقدار ΔΔCT برابر با 5- است. بنابراین تغییر نسبی در بیان ژن هدف نسبت به ژن مرجع برابر است با 2-(-5) که می شود 32 برابر. توجه به این نکته مهم است که مقدار ΔΔCT معیار کاملی برای بیان ژن نسبی نیست. مقدار ΔΔCT می تواند تحت تأثیر عوامل مختلفی قرار گیرد، از جمله:

• کیفیت الگوی DNA
• غلظت الگوی DNA
• کارایی واکنش PCR
• کیفیت پروب فلورسنت
• تنظیمات ابزار

کنترل این عوامل برای اطمینان از نتایج دقیق مهم است.

در اینجا چند نکته اضافی برای تجزیه و تحلیل داده های qPCR برای بیان ژن نسبی وجود دارد:

• از یک ژن مرجع استفاده کنید که در یک سطح ثابت در همه نمونه ها بیان می شود.
• از یک منحنی استاندارد برای کالیبره کردن داده های خود استفاده کنید. این اطمینان حاصل می کند که نتایج شما دقیق و قابل تکرار هستند.
• از یک پروب فلورسنت با کیفیت بالا استفاده کنید. این اطمینان حاصل می کند که نتایج شما حساس و قابل اعتماد هستند.
• از ابزار قابل اعتماد استفاده کنید. این اطمینان حاصل می کند که نتایج شما دقیق و قابل تکرار هستند.
• از کنترل های مناسب استفاده کنید. این به شما کمک می کند تا هر گونه خطا در داده های خود را شناسایی و تصحیح کنید.
• تجزیه و تحلیل آماری داده های خود را انجام دهید. این به شما کمک می کند تا روندها و الگوهای موجود در داده های خود را شناسایی کنید.
• از محدودیت های qPCR آگاه باشید. این تکنیک کامل نیست و تعدادی از عوامل می توانند بر نتایج تأثیر بگذارند.
• متدهای محاسبه بیان نسبی ژن مختلف می باشند. با توجه به نوع Efficiency آزمایش PCR شما باید یکی از متد های livak یا pfaffl برای آنالیز داده های خود انتخاب کنید.